【摘要】  　　目的： 初步探討人類β1，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶7（β3GalT7）基因?qū)�HL60細(xì)胞的細(xì)胞周期、侵襲能力等方面的影響。方法： 通過脂質(zhì)體介導(dǎo)將本實驗室構(gòu)建好的β3GalT7真核正義表達(dá)載體pEGFP�睠1�睺7�睸ense和反義表達(dá)載體pEGFP�睠1�睺7�睞ntiSense轉(zhuǎn)染入HL60細(xì)胞；流式細(xì)胞儀分析各細(xì)胞株的細(xì)胞周期改變；Transwell侵襲實驗檢測β3GalT7對HL60細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響。結(jié)果： 隨著β3GalT7 表達(dá)的增高，G2+S期細(xì)胞增多，且細(xì)胞侵襲能力增強；而轉(zhuǎn)染反義表達(dá)載體pEGFP�睠1�睺7�睞ntiSense的結(jié)果是相反的。結(jié)論： 過度表達(dá)β3GalT7的HL��60細(xì)胞株體外增殖和侵襲能力增強。

【關(guān)鍵詞】  β1，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶7； 正義表達(dá)載體； 反義表達(dá)載體； 細(xì)胞周期； 侵襲

　　［Abstract］Objective: To explore the effects of β3GalT7 gene on cell cycle, invasive potential of HL��60.Methods： Transfect the recombinant plasmids pEGFP�睠1�睺7�睸ense and pEGFP�睠1�睺7�睞ntiSense into HL��60 with  liposomes.Cell cycle and  invasive potential of the transfected cells with flow cytometry and transwell plate,respectively. Results： As the up�瞨egulation expression of β3GalT7, the cell growth rate increased. At 48 h after transfection, significantly increased invasiveness was noted in HL60 transfected with pEGFP�睠1�睺7�睸ense.  Conclusion： Over�瞖xpressing β3GalT7 in HL��60 enhanced proliferative and invasive potential.

　　［Key words］beta 1, 3�瞘alactosyltransferase 7；plus sense recombinant plasmid； antisense recombinant plasmid；cell cycle；invasive potential

    β1,3�舶肴樘腔�轉(zhuǎn)移酶家族是糖基轉(zhuǎn)移酶超家族中最具代表性的酶家族之一，β1,3�舶肴樘腔�轉(zhuǎn)移酶7(beta1,3�瞘alactosyltransferase 7,β3GalT7)基因是我們實驗室從人肺cDNA文庫中克隆到的人類β3�舶肴樘腔�轉(zhuǎn)移酶家族中的一個新成員［1,2］。
   
　　在此之前，β1,3�舶肴樘腔�轉(zhuǎn)移酶家族已經(jīng)克隆到6個成員(β3Gal�睺1,T2,T3,T4,T5,T6)［3］。他們都以UDP�拨联睤�舶肴樘牵║DP�拨联睪al）為供體基團(tuán)，與之結(jié)合，把半乳糖（Gal）轉(zhuǎn)移給受體底物，如各種不同的糖蛋白，糖胺聚糖，糖脂或激素等脂質(zhì)小分子。研究顯示，這些家族的許多成員可能與腫瘤的發(fā)生發(fā)展和浸潤轉(zhuǎn)移有關(guān)。在多種腫瘤細(xì)胞株中，β3GalT7都有不同程度的表達(dá)，而β3GalT7基因在急性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞株HL60細(xì)胞中有中度表達(dá)。
   
　　為進(jìn)一步闡明β3GalT7與腫瘤增殖和浸潤轉(zhuǎn)移的相關(guān)性，尤其是在惡性血液病中的作用，我們以HL60細(xì)胞株作為研究對象，分別特異性地上調(diào)及抑制β3GalT7基因在HL60細(xì)胞的表達(dá)，從而對其功能進(jìn)行初步的研究。

　　1  材料和方法

　　1.1  材料

　　1.1.1  細(xì)胞來源

　　急性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞株HL60購自上海生化細(xì)胞所。

　　1.1.2  主要試劑

　　小牛血清購自南京大治生物公司；1640完全培養(yǎng)基：每升RPMI1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基（Gibco,美國）中，添加小牛血清100 ml、L�补劝滨０�0.15 g，NaHCO3 2.0 g、葡萄糖3.6 g、HEPES(Amresco進(jìn)口分裝)4.7 g；胰蛋白酶購自Sigma公司；DEPC購自上海華舜生物工程公司；六堿基隨機(jī)引物購自Invitrogen公司；Trizol，RNase Inhibitor，Superscript Ⅱ RNase H Reverse transcriptase購自Invitrogen公司；Taq DNA酶，dNTP MIX（10 mmol/L），10×PCR緩沖液，MgCl2(25 mmol/L)購自Promega公司；DNA 標(biāo)準(zhǔn)參照物購自南京大治公司;瓊脂糖購自華美公司（Promega進(jìn)口分裝）。職稱論文怎么發(fā)表

　　1.2  方法

　　1.2.1  細(xì)胞轉(zhuǎn)染

　　通過lipofectamine 2 000脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法將正義重組載體pEGFP�睠1�睺7�睸ense 和反義重組載體pEGFP�睠1�睺7�睞ntiSense及空表達(dá)載體pEGFP�睠1分別轉(zhuǎn)染急性粒細(xì)胞白血病HL��60細(xì)胞，分別命名為HL60�睸,HL60�睞S及HL60��0。48 h后收集細(xì)胞，在熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染后細(xì)胞。

　　1.2.2  β3GalT7 mRNA表達(dá)的RT�睵CR檢測

　　分別收集處于生長對數(shù)期的細(xì)胞按 Trizol Reagent(Invitrogen公司) 操作手冊提取總 RNA, 1%甲醛變性瓊脂糖電泳檢測 RNA完整性。取總 RNA 2 μg反轉(zhuǎn)錄為 cDNA第1鏈,再進(jìn)行 PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物以 2%的瓊脂糖凝膠電泳,溴化乙啶染色,圖像分析儀攝像并分析結(jié)果。設(shè)計引物采用Genetyx軟件,并經(jīng)基因庫Blast進(jìn)行同源檢索后合成。引物由上海生工生物工程公司合成。引物序列為：正義鏈 5′�睠TATGTGCCCGAGTCCTTCTTCG��3′(1324��1346 nt），反義鏈5′�睪CAGTTGTTTCCAGAGCCGAATG��3′(1603��1625 nt)，預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物長度302 bp。PCR反應(yīng)體系50 μl,反應(yīng)條件: 95℃預(yù)變性 3 min, 95℃ 30 s, 56℃ 45 s, 72℃ 1 min,35個循環(huán),72℃延長 10 min。

　　1.2.3  蛋白質(zhì)印跡檢測β3GalT7在蛋白水平的表達(dá)

　　用蛋白質(zhì)印跡方法(按分子克隆操作)，檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞中β3GalT7表達(dá)的變化。

　　1.2.4  流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期的變化

　　待測樣本制成單細(xì)胞懸液，然后2 000 g離心5 min，棄上清。用4℃預(yù)冷的70%乙醇固定，4℃保存，固定18 h以上。調(diào)整細(xì)胞濃度為106細(xì)胞/ml，取1 ml細(xì)胞懸液，用PBS洗3次，細(xì)胞重懸于1 ml碘化丙啶(propyldium iodide,PI)染液中，37℃孵育30 min即可進(jìn)行流式分析G1期和G2，S期比例。PI染液終濃度為50 μg/ml，RNase終濃度為20 μg /ml。

　　1.2.5  轉(zhuǎn)染細(xì)胞的體外穿膜實驗

　　采用Transwell Polycarbonate Membrane模擬體外細(xì)胞侵襲模型。上下室之間置8 μm 微孔濾膜,將Matrigel稀釋成5 mg/L，膜上鋪50 μl稀釋的Matrigel;下室加入含有5 mg/L纖維連接蛋白的無血清培養(yǎng)基，上室加預(yù)處理的轉(zhuǎn)染48 h和對照組HL60細(xì)胞懸液,調(diào)節(jié)濃度為1×105/室，各取 200 μl。37 ℃,5% CO2飽和濕度下培養(yǎng)24 h,取出insert槽，將下層溶液混勻，對其中的細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)，得出穿膜細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的百分比，代表細(xì)胞侵襲力。
1.2.6  統(tǒng)計學(xué)處理

　　采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件，計量資料數(shù)據(jù)用均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，兩組間均數(shù)比較采用t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

　　2  結(jié)果

　　2.1  熒光成像系統(tǒng)觀察轉(zhuǎn)染后細(xì)胞
    
　　將細(xì)胞置于熒光顯微鏡下，可以看到轉(zhuǎn)染后的HL60細(xì)胞在激發(fā)波長為507 nm時發(fā)出綠色熒光(圖1)。

　　2.2  RT�睵CR檢測β3GalT7 mRNA的表達(dá)

    轉(zhuǎn)染pEGFP�睠1�睺7�睸ense載體的HL60�睸組細(xì)胞的β3GalT7 mRNA表達(dá)量相對于空白對照的HL60細(xì)胞株有了明顯提高，而HL60�睞S組細(xì)胞株相對于空白對照的HL60細(xì)胞株其β3GalT7 mRNA表達(dá)量得到了抑制，轉(zhuǎn)染pEGFP�睠1空載體的HL60��0組細(xì)胞的β3GalT7 mRNA表達(dá)量相對于空白對照沒有明顯變化（圖2)。

　　2.3  蛋白質(zhì)印跡檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞β3GalT7蛋白表達(dá)量

    將4組細(xì)胞HL60,HL60��0,HL60�睸,HL60�睞S提取蛋白進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡檢測β3GalT7的表達(dá)情況。發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染了pEGFP�睠1�睺7�睸ense載體的HL60�睸細(xì)胞其β3GalT7的蛋白表達(dá)量有所增加，而轉(zhuǎn)染了pEGFP�睠1�睺7�睞ntiSense載體的HL60�睞S細(xì)胞其β3GalT7的蛋白表達(dá)則受到了抑制，轉(zhuǎn)染了空載體的HL60��0 細(xì)胞β3GalT7蛋白表達(dá)無明顯變化(圖3)。

　　2.4  流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期的改變

    收集轉(zhuǎn)染后48 h的細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞周期分析，結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染β3GalT7上調(diào)表達(dá)HL60細(xì)胞G2期和S期比例（70.1±3.24）%高于對照組（65.2±2.38）%（P<0.05），轉(zhuǎn)染β3GalT7下調(diào)表達(dá)的HL60細(xì)胞G2期和S期比例（55.8±3.82）%低于對照組（P<0.05），轉(zhuǎn)染空表達(dá)載體的G2期和S期比例（66.7±2.52）%和對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

    2.5  轉(zhuǎn)染細(xì)胞的體外穿膜實驗結(jié)果

    轉(zhuǎn)染后48 h，Transwell板檢測發(fā)現(xiàn)pEGFP�睠1�睺7�睸ense組下槽細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的(11.82±1.18)%，pEGFP�睠1�睺7�睞ntiSense組下槽細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的（3.24±0.89）%，pEGFP�睠1載體組下槽細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的(8.05±1.45)%。對照組下槽細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的(6.92 ±1.21)%。pEGFP�睠1�睺7�睸ense組細(xì)胞侵襲能力明顯高于對照組（P<0.05），而pEGFP�睠1�睺7�睞ntiSense組細(xì)胞侵襲能力明顯低于對照組（P<0.05），pEGFP�睠1組細(xì)胞侵襲能力和對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(圖4）。職稱論文怎么發(fā)表
   
　　3  討論
    
　　細(xì)胞癌變過程中常伴有糖鏈結(jié)構(gòu)改變, 目前認(rèn)為腫瘤細(xì)胞糖蛋白糖鏈結(jié)構(gòu)異常是惡性轉(zhuǎn)化和腫瘤轉(zhuǎn)移的普遍特征，如糖鏈分支末端出現(xiàn)重復(fù)N�惨阴０被�半乳糖結(jié)構(gòu)、唾液酸和巖藻糖含量增加等,這些變化在臨床上常用作腫瘤標(biāo)記物。糖鏈結(jié)構(gòu)改變可反映在細(xì)胞表面糖復(fù)合物上,也可反映在分泌的糖復(fù)合物中,而主要是在細(xì)胞表面糖復(fù)合物上。因此,細(xì)胞表面的改變必然對癌細(xì)胞之間及癌細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間的相互作用產(chǎn)生影響,對癌細(xì)胞的行為如癌瘤增大、侵襲與轉(zhuǎn)移等也產(chǎn)生重要影響。腫瘤細(xì)胞表面的糖蛋白糖鏈結(jié)構(gòu)異常的基礎(chǔ)是糖基轉(zhuǎn)移酶的變化，因此有人認(rèn)為，糖基轉(zhuǎn)移酶就是通過影響糖鏈的改變,而間接關(guān)系到癌瘤的發(fā)展。Ishida等［4］曾報道β3GalT7（β3Gn�睺8）在結(jié)腸癌中顯著上調(diào)，與結(jié)腸癌關(guān)系密切。
   
　　過去有研究對來自各類白血病患者的細(xì)胞以及白血病細(xì)胞株中糖基轉(zhuǎn)移酶活性進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，除了慢性淋巴性白血病中巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶活性較正常低外，其他被測酶的活性都是白血病細(xì)胞較正常細(xì)胞高，而且各種酶之間表達(dá)分布也有明顯差異。本室之前的研究表明，β3GalT7基因在HL60細(xì)胞中呈中度表達(dá)，在本研究中，我們通過將本室構(gòu)建好的β3GalT7正義與反義表達(dá)載體轉(zhuǎn)染人HL60細(xì)胞，來上調(diào)及抑制β3GalT7基因在HL60細(xì)胞的表達(dá)，初步研究β3GalT7基因的生物學(xué)功能。

    在腫瘤細(xì)胞表面類似黏蛋白的糖蛋白中有豐富的O�蔡腔�化結(jié)構(gòu)域，在腫瘤的轉(zhuǎn)移和浸潤生長過程中黏蛋白起著重要的作用，O�蔡腔�化可能與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［5］。在O�蔡腔�化過程中，β1,3�舶肴樘腔�轉(zhuǎn)移酶家族發(fā)揮重要功能。我們的研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞轉(zhuǎn)染了pEGFP�睠1�睺7�睸ense后G1期細(xì)胞減少，G2期和S期細(xì)胞增多，細(xì)胞增殖速度加快；而轉(zhuǎn)染了pEGFP�睠1�睺7�睞ntiSense載體后G2期和S期細(xì)胞減少。大多數(shù)聚糖位于細(xì)胞和分泌的大分子的外周表面，他們處在調(diào)控和介導(dǎo)多種細(xì)胞-細(xì)胞和細(xì)胞-基質(zhì)相互作用的位置。由于糖基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)異常可能會引起糖鏈結(jié)構(gòu)的改變和糖基化位點出現(xiàn)異常，而蛋白質(zhì)糖基化的改變與許多細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)密切相關(guān)。在腫瘤細(xì)胞浸潤和轉(zhuǎn)移過程中基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)受多水平嚴(yán)格調(diào)控，β3GalT7作為糖基轉(zhuǎn)移酶，其表達(dá)的上調(diào)或抑制影響了細(xì)胞表面的糖蛋白糖鏈結(jié)構(gòu)，從而影響受體配體結(jié)合，細(xì)胞通路及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等生物學(xué)行為，因而或許帶來表達(dá)調(diào)控基因的改變。另一方面也有可能因為β3GalT7表達(dá)的異常增高，帶來糖鏈異常，有利于癌細(xì)胞之間或癌細(xì)胞與基質(zhì)之間作用，促使腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)因子表達(dá)增加，而這些因子高表達(dá)反過來又促進(jìn)腫瘤增殖侵襲轉(zhuǎn)移，形成惡性循環(huán)。我們推測β3GalT7表達(dá)上調(diào)可能在腫瘤細(xì)胞的侵襲中起到促進(jìn)作用，這和Transwell體外穿膜的結(jié)果是一致的。鑒于以上結(jié)果我們推測β3GalT7與腫瘤的增殖和浸潤轉(zhuǎn)移是密切相關(guān)的，但其具體機(jī)制有待進(jìn)一步探討。

【參考文獻(xiàn)】
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　　［2］周嘉梁, 黃超群, 吳士良，等.人類新型β3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶基因β3GalT7的克隆和鑒定［J］.生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，2005,32(2): 140-146.

　　［3］Bai X, Zhou D, Brown JR, et al. Biosynthesis of the linkage region of glycosaminoglycans: cloning and activity of galactosyltransferase Ⅱ, the sixth member of the beta 1,3�瞘alactosyltransferase family(beta 3GalT6)［J］. J Biol Chem，2001，276(51): 48189-48195.

　　［4］Ishida H, Togayachi A, Sakai T, et al. A novel beta1,3�睳�瞐cetylglucosaminyltransferase(beta3Gn�睺8), which synthesizes poly�睳�瞐cetyllactosamine, is dramatically upregulated in colon cancer［J］. FEBS Lett, 2005, 579(1): 71-78.

　　［5］Hassan H, Reis CA,Bennett EP, et al. The lectin domain of UDP�睳�瞐cetyl�睤�瞘alactosamine: polypeptide N�瞐cetyl galactosaminyltransferase�睺4 directs its glycopep tide specificities［J］. J Biol Chem, 2000,275(49) : 38197-38205.

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