【摘要】  　　目的通過(guò)自擬方抑制癌湯對(duì)人肺癌NCI-H446細(xì)胞株進(jìn)行干擾研究，探討其增殖抑制作用。希望從苗藥中藥組方中找到抑制肺癌細(xì)胞增殖的新方法。方法將NCI-H446細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，繪制NCI-H446細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，取處在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的NCI-H446細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。首先確定抑癌湯的作用濃度范圍。取細(xì)胞的存活率為50%時(shí)的藥物濃度范圍作為抑癌湯的給藥濃度參考。再將抑癌湯在該濃度范圍內(nèi)分為5個(gè)濃度組；實(shí)驗(yàn)分抑癌湯組、西藥組、抑癌湯加西藥組、空白組四組、每一組各4個(gè)復(fù)孔，進(jìn)行對(duì)照研究。結(jié)果抑癌湯對(duì)NCI-H446細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)得到細(xì)胞存活率50%時(shí)的藥物濃度范圍在1～100 μg/ml之間。抑癌湯加西藥組優(yōu)于抑癌湯組；抑癌湯加西藥組優(yōu)于西藥組；西藥組優(yōu)于抑癌湯組；抑癌湯組優(yōu)于空白組；抑癌湯加西藥組優(yōu)于空白組；西藥組優(yōu)于空白組。結(jié)論抑癌湯在體外對(duì)人肺小細(xì)胞肺癌NCI-H446細(xì)胞具有抑制作用，具有潛在藥用價(jià)值，值得進(jìn)一步深入研究。

【關(guān)鍵詞】  自擬方　抑癌湯　 肺癌　 NCI-H446細(xì)胞株　 增殖抑制作用

    原發(fā)性支氣管肺癌（primary bronchogenic carcinoma）腫瘤細(xì)胞起源于支氣管粘膜或腺體，是最常見(jiàn)的肺部原發(fā)性惡性腫瘤。目前肺癌中醫(yī)治療主要用于以下幾個(gè)方面：①對(duì)于分化較好的非小細(xì)胞肺癌不能手術(shù)或術(shù)后、放療后復(fù)發(fā)者，單用中醫(yī)藥治療可獲比放、化療較好的效果；②配合手術(shù)、放化療，起到減毒增效作用，即減少毒副反應(yīng)，提高療效；③晚期肺癌西醫(yī)無(wú)特殊治療者，應(yīng)用中醫(yī)藥可改善癥狀，提高生存質(zhì)量，延長(zhǎng)生存期，并在抗復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移方面有一定的優(yōu)勢(shì)。苗族醫(yī)藥是苗族人民在長(zhǎng)期生產(chǎn)和生活實(shí)踐中與疾病作斗爭(zhēng)的經(jīng)驗(yàn)總結(jié)和智慧結(jié)晶。苗醫(yī)藥認(rèn)為癌是由于致癌惡毒引起細(xì)胞異常增生和變性的惡毒病癥。為了從中藥、民族藥中尋找能抑制肺癌腫瘤細(xì)胞增殖的藥物，我們開(kāi)展由中藥、苗藥組成的抑癌湯對(duì)人肺癌NCI-H446細(xì)胞株進(jìn)行干擾研究。現(xiàn)報(bào)道如下。

　　1  材料

　　1.1  苗藥中藥處方八月扎20 g，白花蛇舌草20 g，半枝蓮20 g，三尖杉20 g，白英20 g，石見(jiàn)穿20 g 。

　　1.2  陽(yáng)性對(duì)照藥物金喜素（注射用鹽酸托泊替康）， 貴州漢方制藥有限公司，批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H20000428   規(guī)格：2 mg/瓶。

　　1.3  人肺小細(xì)胞肺癌NCI-H446細(xì)胞株人肺小細(xì)胞肺癌NCI-H446細(xì)胞株購(gòu)買于南京凱基生物科技發(fā)展有限公司， 培養(yǎng)要求：貼壁培養(yǎng)：
   
　　培養(yǎng)基：RPMI-1640 +10%小牛血清+1%雙抗

    消化液：0.25%胰蛋白酶

    凍存液：胎牛血清：DMSO=9：1

    培養(yǎng)條件：二氧化碳培養(yǎng)箱：5%CO2，37℃

　　2  方法

　　2.1  給藥方法

　　2.1.1  苗藥中藥組方煎煮和滅菌方法首先將待煎的藥物用冷水浸泡30    min，加水以浸泡后淹沒(méi)藥材2～3 cm為度。稱取藥物重量約120 g，使用砂鍋煎煮。煎煮用武火煎至微沸，再用文火煎煮，煎煮時(shí)間是以文火煎煮時(shí)間考察的，煎煮30 min。為了充分利用藥材，避免浪費(fèi)，更好發(fā)揮藥效，煎煮兩次。煎煮時(shí)應(yīng)當(dāng)注意攪拌。再將兩次煎煮好的湯藥倒在一起，進(jìn)行濃縮。將濃縮好的抑癌湯經(jīng)過(guò)紗布、濾紙過(guò)濾，得到湯藥約120 ml。即得到抑癌湯生藥濃度為1g/ml。再經(jīng)過(guò)高壓消毒鍋滅菌，4℃冰箱存放備用。

　　2.1.2  金喜素（注射用鹽酸托泊替康）人體每日用量：1.2 mg/m2

　　2.2  人肺小細(xì)胞肺癌NCI-H446細(xì)胞的培養(yǎng)

　　2.2.1  細(xì)胞鑒定對(duì)收到的細(xì)胞株進(jìn)行鑒定，由專職病理老師在倒置顯微鏡下觀察鑒定，并結(jié)合南京凱基生物科技發(fā)展有限公司提供的細(xì)胞資料，鑒定為NCI-H446細(xì)胞株。

    細(xì)胞株收到后，細(xì)胞培養(yǎng)瓶完好無(wú)損，培養(yǎng)液無(wú)外滲，培養(yǎng)液無(wú)混濁。在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞密度，匯合度約為60%，未達(dá)到細(xì)胞傳代要求的匯合度80%的要求，將培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)液吸出，留10 ml培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，細(xì)胞形態(tài)呈現(xiàn)圓形或梭性。過(guò)了2 d后細(xì)胞匯合度超過(guò)80%后，按細(xì)胞傳代要求進(jìn)行傳代。
   
　　細(xì)胞高度惡性，未分化。癌細(xì)胞體積小，核圓形和卵圓形，癌細(xì)胞胞漿少，核漿比例明顯增大，核外形不規(guī)則，核分裂多見(jiàn)，癌細(xì)胞界限不清。

　　2.2.2  細(xì)胞傳代繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞，直到細(xì)胞匯合度達(dá)到細(xì)胞傳代為80%的要求時(shí)，進(jìn)行細(xì)胞傳代。在NCI-H446細(xì)胞瓶?jī)?nèi)加入0.25%胰蛋白酶，消化3～6 min，加入培養(yǎng)基吹打，制作成細(xì)胞懸液按1∶2傳代。

    按細(xì)胞培養(yǎng)條件進(jìn)行傳代，經(jīng)過(guò)3次傳代培養(yǎng)后，細(xì)胞一共有8瓶。細(xì)胞形態(tài)呈現(xiàn)圓形或梭性，將其中4瓶?jī)龃妗��?瓶用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，另外2瓶繼續(xù)傳代培養(yǎng)。

　　2.3  細(xì)胞生長(zhǎng)曲線繪制

　　2.3.1  細(xì)胞加樣計(jì)算細(xì)胞濃度2次，得出細(xì)胞濃度平均值。然后將細(xì)胞懸液等量的加入培養(yǎng)板的每個(gè)孔中，每天觀察4個(gè)孔，培養(yǎng)時(shí)間計(jì)為7 d。

　　2.3.2  觀察指標(biāo)每隔24 h吸去4個(gè)孔的培養(yǎng)液，加入消化液，混懸細(xì)胞，計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)目。每個(gè)孔計(jì)數(shù)2次，得出細(xì)胞濃度平均值。

　　2.3.3  繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線橫坐標(biāo)為培養(yǎng)時(shí)間，縱坐標(biāo)為細(xì)胞濃度，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。細(xì)胞倍增時(shí)間約為26 h。結(jié)果見(jiàn)圖1。

　　2.4  細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)

　　2.4.1  細(xì)胞加樣取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，將細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，再將細(xì)胞懸液加入細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)，配制為5 000個(gè)/ml細(xì)胞濃度，將其接種細(xì)胞培養(yǎng)板。96孔細(xì)胞培養(yǎng)板每孔100 μl，放入37℃，5%CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。

　　2.4.2  加藥方法細(xì)胞加樣后經(jīng)過(guò)24 h培養(yǎng)，從二氧化碳培養(yǎng)箱中取出96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，在通過(guò)倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，確定細(xì)胞生長(zhǎng)良好后，按實(shí)驗(yàn)分組用取樣器每孔加入相應(yīng)液體各5 μl。每組4個(gè)復(fù)孔。

　　2.4.3  檢測(cè)方法再經(jīng)過(guò)24 h培養(yǎng)后，在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中加入MTT溶液10 μl,繼續(xù)培養(yǎng)4 h。吸去培養(yǎng)液，加入與培養(yǎng)液相同量的DMSO。然后振蕩10 min，使結(jié)晶充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)定光吸收值。

　　2.4.4  實(shí)驗(yàn)分組根據(jù)抑癌湯細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)求出的抑癌湯I(xiàn)C50值，得出抑癌湯的IC50值所在的給藥濃度范圍。本實(shí)驗(yàn)IC50值所在的給藥濃度范圍在1～100 μg/ml之間。因此實(shí)驗(yàn)分組如下：

    抑癌湯組：取抑癌湯組的中間濃度（60 μg/ml）；
   
　　抑癌湯加西藥組：取抑癌湯組的中間濃度（60μg/ml）并加用西藥；
 
　　2.4.5  觀察指標(biāo) 在酶標(biāo)儀上測(cè)定光吸收值，測(cè)定波長(zhǎng)為490 nm，測(cè)定OD數(shù)值。并進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。

　　2.4.6  繪制細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)圖表細(xì)胞存活率（%）=實(shí)驗(yàn)組光吸收值/對(duì)照組光吸收值×100%，對(duì)照組為只加等量的細(xì)胞培養(yǎng)液而不加任何藥物。細(xì)胞增殖抑制率（%）=(1-細(xì)胞存活率)×100%。以時(shí)間為橫軸，以細(xì)胞增殖抑制率為縱軸，繪制細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)圖表。

　　2.5  實(shí)驗(yàn)條件控制全部實(shí)驗(yàn)在遵義醫(yī)學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室完成，細(xì)胞培養(yǎng)及相關(guān)檢測(cè)在其細(xì)胞培養(yǎng)室完成。

　　2.6  統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法方差分析兩兩差異比較用LSD-t檢驗(yàn)［2］，兩者間比較用均數(shù)比較。統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件應(yīng)用Microsoft Excel2000進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

　　3  結(jié)果

　　3.1  不同濃度抑癌湯對(duì)NCI-H446細(xì)胞的增殖抑制作用人小細(xì)胞肺癌NCI-H446細(xì)胞在20，40，60，80，100 μg/ml的5個(gè)濃度上，癌細(xì)胞呈現(xiàn)出相應(yīng)的變化：即隨著抑癌湯藥物濃度的增高癌細(xì)胞數(shù)量明顯減少。NCI-H446細(xì)胞在低濃度20 μg/ml時(shí)，細(xì)胞數(shù)量最多癌細(xì)胞被相互積壓而呈現(xiàn)出變形狀態(tài)。NCI-H446細(xì)胞在較高濃度80 μg/ml時(shí)，癌細(xì)胞呈卵圓形，梭形；核大、胞漿少；核仁不明顯，核分裂不明顯。NCI-H446細(xì)胞在較高濃度100 μg/ml時(shí)，細(xì)胞數(shù)量繼續(xù)減少，癌細(xì)胞呈結(jié)構(gòu)不清。

　　3.2  同濃度抑癌湯對(duì)NCI-H446細(xì)胞的增殖抑制率

    抑癌湯在20，40，60，80，100 μg/ml各濃度和在24，48，72 h這3個(gè)觀測(cè)時(shí)間點(diǎn)與空白組（培養(yǎng)基對(duì)照組）比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
   
　　抑癌湯組3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)分析得到：P=0.492，即抑癌湯組3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)具有可重復(fù)性。結(jié)果顯示不同濃度抑癌湯作用48 h對(duì)NCI-H446細(xì)胞的增殖具有明顯的抑制作用，隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)抑制作用逐漸減弱，且隨著給藥劑量的增大，抑制作用增強(qiáng)。抑癌湯在24 ，48，72  h的抑制率分別達(dá)到53.47%，54.47%和10.45%。3次實(shí)驗(yàn)的抑癌湯的最高抑制率分別達(dá)到54.47%，53.2%和46%。表1   抑癌湯對(duì)NCI-H446細(xì)胞的增殖抑制作用(略)表2   給藥組抑制率數(shù)據(jù)(略)

　　3.3   四個(gè)給藥組（抑癌湯組、抑癌湯加西藥組、西藥組、空白組）之間的比較

　　3.3.1  細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察抑癌湯組選用的中間濃度（60 μg/ml）。人小細(xì)胞肺癌NCI-H446細(xì)胞在4種不同給藥方式作用下呈現(xiàn)不同細(xì)胞形態(tài)。其中抑癌湯加西藥組在48 h觀察點(diǎn)上效果最明顯，細(xì)胞核完全固縮，核溶解，細(xì)胞輪廓難以辨認(rèn)；其次是西藥組，細(xì)胞呈現(xiàn)出細(xì)胞核固縮，核溶解，細(xì)胞輪廓勉強(qiáng)可以辨認(rèn)；再次是中藥組，細(xì)胞呈現(xiàn)出偶爾有細(xì)胞核固縮，細(xì)胞輪廓清楚，細(xì)胞數(shù)量最多癌細(xì)胞被相互積壓而呈現(xiàn)出變形狀態(tài)，癌細(xì)胞呈卵圓形，梭形但不規(guī)整；空白出細(xì)胞存活狀態(tài)良好，核大、胞漿少；核仁不明顯，核分裂活躍，只是偶爾有衰老細(xì)胞增多。

　　3.3.2  不同給藥方式對(duì)NCI-H446細(xì)胞的增殖抑制率

    抑癌湯組選用的中間濃度（60 μg/ml）。抑癌湯加西藥組與抑癌湯組；抑癌湯加西藥組與西藥組；抑癌湯組與西藥組；抑癌湯組與空白組；抑癌湯加西藥組與空白組；西藥組和空白組的細(xì)胞抑制率有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

    通過(guò)給藥組間均數(shù)兩兩比較：抑癌湯加西藥組優(yōu)于抑癌湯組；抑癌湯加西藥組優(yōu)于西藥組；西藥組優(yōu)于抑癌湯組；抑癌湯組優(yōu)于空白組；抑癌湯加西藥組優(yōu)于空白組；西藥組優(yōu)于空白組并有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

　　4  討論

    原發(fā)性支氣管肺癌（primary bronchogenic carcinoma）簡(jiǎn)稱肺癌（lung cancer）。腫瘤細(xì)胞起源于支氣管粘膜或腺體，是最常見(jiàn)的肺部原發(fā)性惡性腫瘤［3］。在我國(guó)城市人口中，肺癌的死亡率已由第四位躍居為各種腫瘤的首位，農(nóng)村中上升最快的也是肺癌。肺癌的歷史只有五百余年。1420年在德國(guó)薩克森的一座礦山發(fā)現(xiàn)了首例肺癌。1875年在痰中首次見(jiàn)到癌細(xì)胞［4］。有專家預(yù)言：如果不能有效地控制吸煙和空氣污染，到2025年我國(guó)每年的肺癌人數(shù)將超過(guò)100萬(wàn)，成為世界第一肺癌大國(guó)［5］。就臨床角度而言，肺癌可分為兩類：即小細(xì)胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)和非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)。其中小細(xì)胞肺癌大約占肺癌的25%。由于癌組織迅速擴(kuò)散，絕大多數(shù)患者失去外科手術(shù)切除的機(jī)會(huì)，臨床過(guò)程一般不超過(guò)3個(gè)月。而腫瘤細(xì)胞的特征之一是異常增殖，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖是治療腫瘤的途徑之一，也是抗腫瘤藥物的基本要求。

    在祖國(guó)醫(yī)學(xué)中雖然無(wú)肺癌這一病名，但文獻(xiàn)中描述的“肺積”的臨床表現(xiàn)與肺癌較為相似，可以歸于“咳嗽”“痰飲”“肺積”“咯血”等病證的范疇。其主要的臨床表現(xiàn)：上氣咳嗽，喘促胸痛，咳痰咯血，胸悶氣急，發(fā)熱口干，氣短乏力，腰酸腿軟，畏寒怕冷［6］ 。隨著中醫(yī)學(xué)理論的日臻完善和臨床經(jīng)驗(yàn)的不斷積累，現(xiàn)已逐漸探索并形成了一門新的醫(yī)學(xué)學(xué)科——具有較為完整理論體系和辨證論治規(guī)范的中醫(yī)腫瘤學(xué)［7］。目前肺癌中醫(yī)治療主要用于以下幾個(gè)方面：①對(duì)于分化較好的非小細(xì)胞肺癌不能手術(shù)或術(shù)后、放療后復(fù)發(fā)者，單用中醫(yī)藥治療可獲比放、化療較好的效果；②配合手術(shù)、放化療，起到減毒增效作用，即減少毒副反應(yīng)，提高療效；③晚期肺癌西醫(yī)無(wú)特殊治療者，應(yīng)用中醫(yī)藥可改善癥狀，提高生存質(zhì)量，延長(zhǎng)生存期［8］ ，并在抗復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移方面有一定的優(yōu)勢(shì)［6］ 。

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