【摘要】  目的： 構(gòu)建幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，Hp)Cag致病島(Cag�瞤athogenicity island，Cag�睵AI)編碼的hp0540基因的原核表達(dá)系統(tǒng)，并制備其多克隆抗體。方法： 應(yīng)用PCR技術(shù)從Hp11637基因組DNA中擴(kuò)增hp0540基因片段，克隆至pMD18��2T載體后，進(jìn)行序列測(cè)定，并對(duì)其序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析;構(gòu)建pET��28a�瞙p0540原核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌BL21DE3;經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，SDS-PAGE法鑒定目的蛋白的表達(dá)，并以Ni2+�睳TA柱分離純化目的蛋白;將純化蛋白免疫新西蘭大白兔制備多克隆抗體并測(cè)定抗體效價(jià)。結(jié)果： 成功克隆了hp0540基因，全長(zhǎng)1 086 bp，編碼361個(gè)氨基酸，與基因庫(kù)公布的其他Hp菌株基因序列的核苷酸同源性為98%。工程菌誘導(dǎo)后SDS�睵AGE顯示新生表達(dá)蛋白帶，相對(duì)分子質(zhì)量約為39 000，經(jīng)Ni2+�睳TA柱純化后可獲得重組蛋白，重組蛋白免疫新西蘭大白兔后獲得效價(jià)為1∶160 000的多克隆抗體。結(jié)論： 成功構(gòu)建了hp0540基因的原核表達(dá)系統(tǒng)并制備了其多克隆抗體，為研究該基因的功能奠定了基礎(chǔ)。

【關(guān)鍵詞】  幽門螺桿菌; Cag致病島; CagI; 多克隆抗體教育類論文發(fā)表

　　[Abstract] Objective: To construct the expression system of hp0540 from strain NCTC11637 of Helicobacter pylori(Hp) and prepare the polyclonal antibody serum of CagI. Methods: The hp0540 gene was amplified by PCR with the genomic DNA of Hp NCTC 11637 as template. The plasmid pMD18��2T�瞙p0540 was constructed via T�睞 clone method and sequenced. The sequence of hp0540 was analyzed through bioinformatics approach. The expression vector pET��28a�瞙p0540 was constructed and transformed into E.coli BL21DE3 by molecular cloning method. The protein was expressed and characterized via SDS�睵AGE method after induced by IPTG. The target protein CagI was purified and collected by Ni2+�睳TA agarose. The puried protein was used to immunize rabbit to prepare polyclonal antibody serum. Results: The hp0540 has been cloned successfully. The sequence analysis for hp0540 showed that it shared 98% homology with other strains of Hp in GenBank. The molecular mass of the purified protein was 39 000. The potency of the polyclonal antibody serum was 1∶160 000. Conclusion: We constructed the prokaryotic expression system and prepared the polyclonal antibody serum successfully, which established a foundation for the function investigation of the hp0540.

　　[Key words] Helicobacter pylori; Cag�瞤athogenicity island; CagI; polyclonal antibody

　　幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，Hp)是一微需氧革蘭陰性細(xì)菌，世界上有50%人口因感染該菌而導(dǎo)致慢性胃炎、消化性胃潰瘍、胃腺癌、淋巴樣組織瘤等消化道疾病，世界衛(wèi)生組織于1994年將其列為第一類致癌原[1-3]。高致病性菌株都含有一長(zhǎng)度為40 kb的Cag致病島(Cag�瞤athogenicity island，Cag�睵AI)，用以編碼四型分泌系統(tǒng)(type IV secretion system，TFSS)，通過該系統(tǒng)細(xì)菌可以把一些諸如細(xì)胞毒素抗原(CagA)、空泡毒素A(VacA)、肽聚糖等致病因子注入宿主細(xì)胞，并進(jìn)而引起細(xì)胞在增殖、骨架重排、細(xì)胞連接、形態(tài)延伸與散射等方面的改變[4]。hp0540是Cag�睵AI內(nèi)的第19號(hào)基因，與根癌農(nóng)桿菌的Ti�睤NA轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)中的基因不具有同源性，由hp0540編碼的CagI蛋白是TFSS的一伴侶樣蛋白。有研究表明CagI蛋白可以與新近發(fā)現(xiàn)的宿主整合素受體β1發(fā)生相互作用，從而影響毒力因子CagA的轉(zhuǎn)運(yùn)，但其具體的作用機(jī)制及完整的功能尚不清楚[5]。因此，本文通過對(duì)Cag�睵AI中的hp0540基因進(jìn)行克隆表達(dá)及其多克隆抗體的制備，將為進(jìn)一步研究該基因在Hp致病機(jī)制中的作用奠定基礎(chǔ)。

　　1 材料和方法

　　1.1 材 料

　　1.1.1 菌株 Hp NCTC11637購(gòu)自中國(guó)預(yù)防科學(xué)院流行病學(xué)研究所,大腸埃希菌DH5α及BL21DE3為江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室保存。

　　1.1.2 主要試劑和儀器 哥倫比亞培養(yǎng)基、厭氧袋購(gòu)自O(shè)XOID公司;Ex�睺aqDNA聚合酶、dNTP、限制性核酸內(nèi)切酶EcoRⅠ與XhoⅠ，T4�睤NA連接酶(快速連接試劑盒)、IPTG、2 000 bp、15 000 bp DNA 標(biāo)準(zhǔn)參照物及蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)(低)均購(gòu)自TaKaRa公司;10 kb DNA 標(biāo)準(zhǔn)參照物購(gòu)自TOYOBO;Ni2+NTA購(gòu)自Qiagen公司;pET28a載體由江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室保存;PCR基因擴(kuò)增儀(Mastercycler Gracent，Eppendor公司)、自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)UVP公司)，其他常規(guī)試劑按照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》配制。

　　1.2 方 法

　　1.2.1 Hp的培養(yǎng)與鑒定及基因組DNA提取 Hp NCTC11637標(biāo)準(zhǔn)菌株按常規(guī)微需氧方法進(jìn)行培養(yǎng)與鑒定。DNA用常規(guī)酚、氯仿抽提法獲得，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

　　1.2.2 hp0540基因的克隆及工程菌的構(gòu)建 根據(jù)基因庫(kù)中已報(bào)道的Hp26695 NC_000915的hp0540基因序列進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)，顯示前60 bp編碼信號(hào)肽，去除前60 bp后利用軟件Primier5.0設(shè)計(jì)引物： p1:5′�睞TAGAATTCACAGAAGTAGTAATAACGCTTGAAC��3′(34 bp);p2:5′�睞GACTCGAGTTTGACAATAACTTTAGAGCTAG��3′(34 bp)。在上游引物5′端加EcoR Ⅰ酶切位點(diǎn);在下游引物5′端加Xho Ⅰ酶切位點(diǎn)。預(yù)期的PCR 產(chǎn)物長(zhǎng)度為1 086 bp。引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。以HpNCTC11637菌株基因組DNA為模板,按照常規(guī)PCR條件進(jìn)行擴(kuò)增, 反應(yīng)體積為50 μl。反應(yīng)條件: 94℃預(yù)變性10 min, 94℃ 50 s, 60℃ 45 s, 72℃ 50 s, 30個(gè)循環(huán),最后于72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析后，用DNA回收試劑盒進(jìn)行回收純化。將純化的PCR 產(chǎn)物克隆到載體pMD18��2T上, 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5a，選擇陽(yáng)性克隆進(jìn)行酶切鑒定。用EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ酶切鑒定陽(yáng)性質(zhì)粒pMD18��2T�瞙p0540,雙酶切得到目的基因片段,然后連接到原核表達(dá)載體pET28a，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸埃希菌BL21DE3,酶切鑒定陽(yáng)性重組質(zhì)粒pET28a�瞙p0540獲得重組工程菌。

　　1.2.3 DNA序列測(cè)定分析及編碼蛋白特性預(yù)測(cè) 將經(jīng)過鑒定的陽(yáng)性重組質(zhì)粒寄至上海生工測(cè)序。基因片段的同源性分析使用NCBI 的Blast在nr數(shù)據(jù)庫(kù)中對(duì)基因的同源性進(jìn)行比對(duì)分析; 應(yīng)用軟件DNAStar分析hp0540編碼氨基酸序列的理化特性。登陸SMART數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)與CagI(hp0540)具有相互作用的蛋白并進(jìn)行同源性比對(duì)。

　　1.2.4 目的蛋白的表達(dá)純化與抗體的制備 取經(jīng)酶切鑒定構(gòu)建成功的重組工程菌,接種于含卡那霉素的3 ml LB液體培養(yǎng)基中,在37℃振蕩培養(yǎng)至光密度D(600 nm)為0.6時(shí)，以不同濃度的IPTG誘導(dǎo)不同的時(shí)間后收集菌液,用PBS洗滌3 次, SDS�睵AGE檢測(cè),以未經(jīng)轉(zhuǎn)化的大腸埃希菌BL21DE3及轉(zhuǎn)化空載體pET28a誘導(dǎo)的菌液為陰性對(duì)照。確定表達(dá)的最佳條件后，大量誘導(dǎo)工程菌，按鎳柱Ni2+�睳TA 純化目的蛋白步驟提取重組蛋白。以純化蛋白為抗原加弗氏佐劑免疫新西蘭大白兔制備兔抗重組蛋白多克隆抗體血清，以ELISA鑒定其免疫性。

　　2 結(jié) 果教育類論文發(fā)表

　　2.1 Hp的分離培養(yǎng)與鑒定

　　培養(yǎng)96 h后的NCTC11637經(jīng)革蘭染色，在油鏡下可見海鷗狀、弧形、s形的革蘭陰性菌，尿素酶、氧化酶、觸酶試驗(yàn)均陽(yáng)性。

　　2.2 hp0540基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

　　PCR結(jié)果顯示在1 086 bp附近出現(xiàn)了條帶(圖1)，與預(yù)期大小相符，無非特異性條帶。

　　2.3 TA克隆重組質(zhì)粒的篩選與鑒定

　　將膠回收后的PCR產(chǎn)物與pMD18��2T載體連接，產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸埃希菌DH5α，涂板、37℃培養(yǎng)12 h后隨機(jī)挑取單菌落搖菌，提取質(zhì)粒，雙酶切鑒定產(chǎn)物，電泳結(jié)果顯示在3 000 bp與1 086 bp左右出現(xiàn)條帶(圖2)。

　　M：10 kb DNA標(biāo)準(zhǔn)參照物; 1：EcoR Ⅰ單酶切鑒定pMD18��2T�瞙p0540; 2：EcoRⅠ、XhoⅠ雙酶切鑒定pMD18��2T�瞙p0540;3：PCR產(chǎn)物

　　2.4 重組表達(dá)質(zhì)粒的酶切鑒定

　　將酶切鑒定為陽(yáng)性的TA質(zhì)粒與pET28a載體分別用EcoRⅠ、XhoⅠ雙酶切，回收目的片段，16℃連接過夜后轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸埃希菌Bl21DE3，涂板、37℃培養(yǎng)12 h，隨機(jī)挑取單菌落搖菌，提取質(zhì)粒，雙酶切鑒定產(chǎn)物電泳結(jié)果顯示大約在5 000 bp與1 086 bp處出現(xiàn)條帶(圖3)。

　　M1：2 000 bp DNA標(biāo)準(zhǔn)參照物; 1：PCR 產(chǎn)物; 2：EcoRⅠ、XhoⅠ雙酶切鑒定pET28a�瞙p0540; 3：EcoR Ⅰ單酶切鑒定pET28a�瞙p0540; M2：15 000 bp DNA標(biāo)準(zhǔn)參照物

　　2.5 hp0540基因片段的序列測(cè)定及編碼蛋白的理化特性預(yù)測(cè)

　　將鑒定后的重組質(zhì)粒送往上海生工進(jìn)行核苷酸序列測(cè)定，DNA測(cè)序結(jié)果表明，構(gòu)建的重組質(zhì)粒上的hp0540長(zhǎng)度為1 086 bp，與設(shè)計(jì)序列大小完全一致。將測(cè)得序列分別與已知的兩種國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)菌株Hp26695和J99的hp0540基因的核苷酸序列進(jìn)行比對(duì)，同源性分別為98%(1067/1086)、 98%(1066/1078)。應(yīng)用DNAStar軟件分析得到CagI(hp0540)的相對(duì)分子質(zhì)量為39 377，等電點(diǎn)PI為5.35。應(yīng)用Jameson�瞁olf法對(duì)其抗原性進(jìn)行了分析(圖4)。登錄SMART數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行的相關(guān)蛋白預(yù)測(cè)顯示：CagI蛋白可能與致病島中的CagL(0.869)、CagH(0.831)、CagA(0.800)、CagG(0.774)、CagF(0.613)、CagE(0.613)、CagD(0.594)、CagC(0.594)等蛋白(括號(hào)內(nèi)為可信度)具有相互作用。

　　2.6 目的蛋白在大腸埃希菌中的表達(dá)

　　將重組質(zhì)粒pET28a�瞙p0540 轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21DE3,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá),收集菌液進(jìn)行SDS�睵AGE電泳檢測(cè)。結(jié)果顯示在大約40 000 處有特異性條帶(圖5) ，與預(yù)期大小一致,而作為對(duì)照的宿主菌與pET28a空質(zhì)粒宿主菌在相應(yīng)位置未見到蛋白條帶。

　　M：蛋白標(biāo)準(zhǔn)參照物;1：E.coli BL21DE3 菌株;2：轉(zhuǎn)化了pET28a空載體的E.coli BL21DE3;3：轉(zhuǎn)化了重組質(zhì)粒卻未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的E.coli BL21DE3;4、5：轉(zhuǎn)化了重組質(zhì)粒并經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的E.coli BL21DE3

　　2.7 多克隆抗體的制備與效價(jià)測(cè)定

　　將純化蛋白免疫家兔，獲得抗CagI多克隆抗體，以免疫之前兔的血清作為陰性對(duì)照，對(duì)抗體進(jìn)行倍比稀釋后做ELISA，測(cè)得抗體效價(jià)為1∶160000。

3 討 論

　　在幽門螺桿菌的致病機(jī)制中，由Cag致病島編碼的蛋白所組成的TFSS構(gòu)成了其最重要的致病因子之一[6-9]。除幽門螺桿菌外，TFSS還存在軍團(tuán)桿菌屬、巴爾通(氏)體屬、博德特氏菌屬等病原菌中，在這些病原菌中TFSS擁有的一個(gè)共同功能就是可以將一些致病因子轉(zhuǎn)移至宿主細(xì)胞，進(jìn)而引發(fā)相應(yīng)的疾病[10-12]。在幽門螺桿菌致病機(jī)制的前期研究中，已經(jīng)表明四型分泌系統(tǒng)的伴侶樣蛋白CagL可與宿主細(xì)胞表面的整合素a5β1受體發(fā)生相互作用，從而啟動(dòng)細(xì)菌主要毒力因子CagA的轉(zhuǎn)運(yùn)，并激活細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)級(jí)聯(lián)放大反應(yīng)，進(jìn)而引起一系列的病理變化[6]。最新的研究揭示了CagA的轉(zhuǎn)運(yùn)還依賴于宿主細(xì)胞的另一整合素受體β1， Jiménez�睸oto等[5]已通過酵母雙雜交的方法證實(shí)了CagA的N端，CagY(hp0527)的C端及CagI(hp0540)均與整合素β1具有相互作用。教育類論文發(fā)表

　　隨著伴侶樣蛋白CagL可啟動(dòng)細(xì)菌主要毒力因子CagA轉(zhuǎn)運(yùn)的發(fā)現(xiàn)，伴侶樣蛋白在致病機(jī)制中的作用已逐漸引起了重視。幽門螺桿菌CagA蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)的伴侶樣蛋白除CagL與CagI外，還包括CagZ(hp0526)、CagU(hp0531)、CagM(hp0537)、CagN(hp0538)、CagG(hp0542)、CagF(hp0543)、CagD(hp0545)。Fischer等[13]的研究表明，在這些蛋白中，CagZ與CagI對(duì)于CagA轉(zhuǎn)運(yùn)是必需的，但對(duì)IL��8的誘導(dǎo)并不產(chǎn)生影響，而CagN、CagG、CagF、CagD對(duì)CagA的轉(zhuǎn)運(yùn)與IL��8的誘導(dǎo)都是必需的，可能與這幾種蛋白具有穩(wěn)定TFSS結(jié)構(gòu)的功能有關(guān)。另有研究表明CagM對(duì)于hp0532基因的表達(dá)具有調(diào)節(jié)作用，而對(duì)CagU蛋白的功能研究卻未見報(bào)道。目前，對(duì)于這些基因的研究尚不夠深入與全面，而全面地揭示這些基因的功能，對(duì)于更好地認(rèn)識(shí)幽門螺桿菌的致病機(jī)制及其四型分泌系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)都極為必要。

　　本研究成功地克隆了幽門螺桿菌NCTC11637的hp0540基因，并制備了CagI蛋白的多克隆抗體。DNA測(cè)序后的序列比對(duì)結(jié)果表明，該基因具有高度保守性，與Hp其他菌株的同源性達(dá)到了98%。在SMART數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行的相關(guān)蛋白預(yù)測(cè)顯示，CagI可能與致病島中的CagL、CagH、CagA、CagG、CagF、CagE、CagD、CagC等蛋白具有相互作用。這將為進(jìn)一步研究該基因?qū)�CagA的轉(zhuǎn)運(yùn)、TFSS的組裝及其致病相關(guān)因子的相互作用奠定了基礎(chǔ)，從而更好地揭示該基因在幽門螺桿菌致病機(jī)制中的作用。

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