【摘要】  目的 探討姜黃素對(duì)雷帕霉素靶蛋白(mTOR)和核糖體蛋白質(zhì)S6激酶(P70S6K)在血管平滑肌細(xì)胞增殖中的作用。方法 54只雄性SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、損傷組和藥物干預(yù)組。頸動(dòng)脈HE染色和組織病理圖像分析;免疫組織化學(xué)觀察PCNA與P70S6K組織表達(dá)中的病理變化;實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)mTOR�睵70S6K及PCNA的mRNA表達(dá);ELISA測(cè)定血清白介素��18(IL��18)水平變化。結(jié)果 實(shí)驗(yàn)術(shù)中死亡大鼠1只，取材過(guò)程中發(fā)現(xiàn)動(dòng)脈閉塞5只(分別為3 d藥物干預(yù)組和7 d損傷組各1只，14和28 d藥物干預(yù)組各2只)。 HE染色顯示14 d藥物干預(yù)組與損傷組相比內(nèi)膜與中膜增殖厚度明顯減低，組織圖像分析三組之間內(nèi)膜厚度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而中膜厚度差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.000);免疫組化結(jié)果示對(duì)照組與損傷組及藥物干預(yù)組存在差異(P=0.045);實(shí)時(shí)熒光定量PCR mTOR�睵70S6K及PCNA的mRNA損傷組與對(duì)照組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);ELISA示與對(duì)照組相比姜黃素能抑制第3、7、14天藥物干預(yù)組血清IL��18濃度，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。結(jié)論 姜黃素能夠抑制IL��18、mTOR�睵70S6k及PCNA在損傷血管平滑肌細(xì)胞中的表達(dá)，并能抑制平滑肌細(xì)胞增殖，可能成為預(yù)防再狹窄的新藥物。

【關(guān)鍵詞】  姜黃素;血管平滑肌細(xì)胞;白介素��18;雷帕霉素靶蛋白;核糖體蛋白質(zhì)S6激酶

　 近年來(lái)，心血管病特別是冠心病的高發(fā)病率、高致殘率和高死亡率給社會(huì)及居民造成沉重負(fù)擔(dān)。經(jīng)皮冠脈介入(PCI)已成為治療冠心病的最有效手段之一，但是其長(zhǎng)期獲益受到了血管再狹窄的限制，Odell和Garg等〔1，2〕研究表明，支架植入術(shù)后9個(gè)月再狹窄率為5%～8%以上。藥物涂層支架使再狹窄率明顯下降，但晚期支架內(nèi)血栓引起了人們的關(guān)注〔3〕。盡管臨床上給予PCI術(shù)后雙聯(lián)甚至三聯(lián)抗血小板藥物，但再狹窄仍是支架置入術(shù)后預(yù)防的重點(diǎn)和難點(diǎn)。球囊機(jī)械損傷，冠脈再狹窄的主要原因是由于血管平滑肌細(xì)胞(VSCM)的異常增殖、遷移和纖維化。姜黃素是從姜黃根莖中提取的一種主要成分，其通過(guò)下調(diào)P13K/Akt通路抑制VSMC增殖與遷移。姜黃素已用于生物可吸收支架，對(duì)PCI術(shù)后再狹窄及支架內(nèi)血栓起到抗增殖及預(yù)防作用〔4〕。目前國(guó)內(nèi)對(duì)雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、核糖體蛋白質(zhì)S6激酶(P70S6K)與白介素��18(IL��18)和再狹窄關(guān)系研究未見(jiàn)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)在于討論姜黃素是否能夠通過(guò)降低mTOR�睵70S6K及IL��18的表達(dá)，從而降低PCI術(shù)后再狹窄的發(fā)生。

　　1 材料與方法

　　1.1 主要藥物及試劑 98%高效液相色譜姜黃素購(gòu)于陜西森弗生物技術(shù)公司;IL��18 ELISA試劑盒及RNA純化試劑Trizol分別購(gòu)于美國(guó)ADL公司與Invitrogen公司;RT�睵CR反轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR試劑盒購(gòu)于日本Toyobo公司;PCNA和P70S6K抗體購(gòu)于美國(guó)BioworlD公司，免疫組化二抗試劑盒購(gòu)于中國(guó)武漢博士德公司。

　　1.2 實(shí)驗(yàn)方法園藝論文發(fā)表

　　1.2.1 動(dòng)物分組及模型 54只(7～8周齡)無(wú)特殊病原體(SPF)級(jí)雄性SD大鼠由甘肅中醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，體重(300±50)g。動(dòng)物批號(hào)：scxk(甘) 2004��0006。隨機(jī)分為對(duì)照組(假手術(shù)組)6只，損傷組與藥物干預(yù)組(損傷加藥物)各24只，又分別分為3、7、14及28 d組。戊巴比妥鈉40 mg/kg腹腔麻醉后，尾靜脈給予肝素100 U/kg。頸前正中切開皮膚及皮下組織，動(dòng)脈夾分別夾住頸總動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈，在頸外動(dòng)脈剪一楔形切口，插入2 F(2×20 mm)球囊(Medtronic，美國(guó))，注入生理鹽水0.2 ml使其膨脹，緩慢回拉球囊至平切口處，抽出球囊內(nèi)液體，重復(fù)上述過(guò)程三次，退出球囊，結(jié)扎頸外動(dòng)脈，恢復(fù)血流。慶大霉素40萬(wàn)U沖洗切口后縫合皮下組織及皮膚。青霉素40萬(wàn)U/d肌肉注射，連續(xù)3 d。普通飼料喂養(yǎng)，自由飲水。對(duì)照組僅切開皮膚分離皮下組織，不插入球囊，藥物干預(yù)組給予姜黃素100 mg·kg-1·d-1灌胃。取材：所有動(dòng)物分別在第3，7，14和28天麻醉后取全血及左側(cè)頸總動(dòng)脈后脫臼處死。全血4 000 r/min離心 20 min取上清-20℃冰箱保存;頸總動(dòng)脈經(jīng)肝素生理鹽水沖洗后分兩等份，40 g/L甲醛固定和液氮保存。

　　1.2.2 IL��18檢測(cè) ELISA按試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行操作。

　　1.2.3 組織病理(HE)及圖像分析及免疫組織化學(xué) 將病理標(biāo)本在40 g/L中性甲醛液中固定24 h后，逐級(jí)乙醇脫水，石蠟包埋，間斷均勻切片(片厚5 μm)。對(duì)病理切片行免疫組化染色，觀察受損血管組織形態(tài)學(xué)改變、同時(shí)采用計(jì)算機(jī)全自動(dòng)圖像分析系統(tǒng)測(cè)定受損血管內(nèi)膜與中膜厚度。

　　1.2.4 實(shí)時(shí)定量PCR醫(yī)學(xué)核心期刊論文發(fā)表

　　1.2.4.1 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)Genbank提供的基因序列及引物設(shè)計(jì)原則應(yīng)用Primer Premier 5和Oligo 6引物設(shè)計(jì)軟件，自行設(shè)計(jì)引物，由北京三博遠(yuǎn)志公司合成。mTOR正鏈5′�睪AATCAGACAGGCACGAAGG��3′，反鏈 5′�睺CTTCTTCCAGCAAGTTCAGC��3′;P70S6K正鏈5′�睞AAGAAGAGGAAGCTGT��3′，反鏈5′�睠TTTAAGTGTCCCATGTCAG��3′;PCNA正鏈5′�睞AAGAAGAGGAAGCTGT��3′，反鏈 5′�睠TTTAAGTGTCCCATGTCAG��3′;β�瞐ctin正鏈5′�睺TGCTGATCCACATCTGCTG��3′，反鏈5′�睪ACAGGATGCAGAAGGAGAT��3′。

　　1.2.4.2 Trizol法抽提總RNA與cDNA合成 將100 mg血管研成勻漿，加入Trizol 1.0 ml，室溫靜置5 min;加入氯仿1/5體積，4℃ 12 000 g離心15 min，抽取上清約500～600 μl，加入異丙醇500 μl混勻，-20℃過(guò)夜;過(guò)夜后4℃ 7 500 r/min離心10 min，棄上清，無(wú)水乙醇1 ml洗滌2次，4 ℃ 7 500 r/min離心5 min，棄上清，室溫放置25 min，加DEPC水30 μl，立即逆轉(zhuǎn)錄(根據(jù)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行)或保存液氮中。

1.2.4.3 PCR反應(yīng)步驟 PCR反應(yīng)體系為25 μl，包括蒸餾水5.5 μl;SYBR GreenⅠ12.5 μl;Plus solution 2.5 μl;上下游引物各1 μl;cDNA 2.5 μl。變性95 ℃ 15 s，退火57 ℃ 15 s，延伸72℃ 45 s，共40循環(huán)。

　　1.3 統(tǒng)計(jì)方法處理 所有資料以x±s表示，組間數(shù)據(jù)比較采用方差分析;秩和檢驗(yàn)分析等級(jí)資料，應(yīng)用SPSS11.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

　　2 結(jié) 果

　　2.1 各組血清IL��18結(jié)果 見(jiàn)表1。第3、7天損傷組及藥物干預(yù)組IL��18水平較對(duì)照組明顯增高(P<0.05)，第14天損傷組高于對(duì)照組(P<0.05)。第3、7、14天藥物干預(yù)組較損傷組

　　低(P<0.05)。環(huán)保論文發(fā)表

　　2.2 HE及免疫組織化學(xué) 對(duì)照組光鏡下內(nèi)皮細(xì)胞和內(nèi)彈力膜完整，中層VSMC呈梭形，胞核小而扁。損傷組損傷后7 d光鏡下管腔面有較完整的扁平內(nèi)皮，增生的內(nèi)膜呈均勻性或非均勻性增厚，有遷移的VSMC和少許纖維組織形成;損傷后14、